一、实时荧光定量PCR（Real Time PCR）技术原理：

实时荧光定量PCR（qPCR），利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。PCR反应过程中产生的DNA拷贝数是呈指数方式增加的，随着反应循环数的增加，最终PCR反应不再以指数方式生成模板，从而进入平台期。将已知浓度的标准品梯度稀释进行Real Time PCR，按照起始DNA量由多到少的顺序等间隔得到一系列扩增曲线。Ct值与起始模板数的对数值之间存在线性关系，可以制作标准曲线。未知浓度的样品也得到Ct值，代入标准曲线，就可以求出未知样品的起始模板量。

Real Time PCR的定量原理图

二、实时荧光定量PCR（Real Time PCR）应用进展：

Real Time PCR是具有划时代意义的技术，具有操作简单、快速方便、灵敏度高、重复性好、污染率低等优点，不仅应用于基因表达解析，还广泛应用于SNP分型解析、物种鉴定、病毒和病原菌的检测、转基因食品的定量分析、导入基因拷贝数的解析等诸多领域。

阈值（threshold）： 在扩增曲线的指数增长区域内适当位置上设定的荧光检出界限。

Ct值（Cycle threshold）： 表示每个PCR反应管内荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。

经数学理论证明，Ct值与起始模板数的对数值成反比线性关系。

阈值和Ct值的相互关系图

三、实时荧光定量PCR（Real Time PCR）部分专业名词：

决定系数（r Squared）

反映标准曲线的直线性，理想值应大于0.98，越接近于1说明直线性越好，定量越准确。

斜率（slope）

反映PCR扩增效率，-0.25～-0.33（根据不同装置数值不同）。

扩增效率（E）

理想扩增效率应在0.8﹤E﹤1.2。

标准曲线的评价指标图例