首先怀疑发生了目的片段以外的扩增。
1. 引物二聚体等非特异性扩增。优化PCR条件或再设计引物。
2. 存在目的基因的Variant。获取Variant信息，再设计引物。
3. Genomic DNA来源的扩增。DNase处理或考虑基因组结构、引物再设计。
但也有偶尔例外的情况。那是由于目的序列内部GC含量等的不均一造成同一扩增产物解离稍有偏差，致使虽然为特异性扩增，但融解曲线分析却出现非单一峰型的情况，但此时电泳确认结果却为单一条带（如下图所示）。因此，对初次使用引物的扩增产物有必要进行电泳确认，其目的有两个：①单一峰型时可以确认扩增片段大小，判断是否为目的产物；②非单一峰型时也有必要对扩增产物进行确认，如果电泳结果显示为单一条带，并与目的片段大小吻合，可以判断为进行了特异性扩增。
熔解曲线分析特例
