进行 Real Time PCR 反应时，设计反应性能良好的 PCR 引物非常重要。根据以下原则，可以设计PCR 扩增效率高，反应特异性强的良好引物。
1、PCR扩增产物长度：80 ~ 150 bp较为合适（可以延长至300 bp）；
2、引物的最适长度为17 ~ 25 bp；
3、引物的GC含量为40% ~ 60%，最好为45% ~ 55%；
4、上游引物和下游引物的Tm值不能相差太大；
5、引物A、T、C、G整体分布尽量均匀，不要有部分的GC富集或者 AT富集，尤其是在3’端；避开T/C或A/G的连续结构；
6、引物3’端碱基最好为G或者C，尽量避免3’末端碱基为T；
7、避开引物内部或者两条引物之间有3个碱基以上的互补序列。两条引物间的3’末端避开有2个碱基以上的互补序列；
8、使用Blast 检索确认引物的特异性。
